Laboratorio de Diagnóstico Molecular

Responsable Sanitario: Dr. Juan Manuel Vargas Morales / juan.vargas@uaslp.mx

Servicio del área de Biología Molecular

En esta área nos enfocamos al entendimiento de las interacciones de los diferentes sistemas de la célula, entre ellas el ADN con el ARN, la síntesis de proteínas y cómo estas interacciones son reguladas para lograr el buen funcionamiento celular. Todas estas técnicas tienen diversas aplicaciones en el diagnóstico de enfermedades hereditarias, enfermedades infecciosas, cáncer. Además, son una herramienta fundamental para la toma de decisiones médicas.

Las técnicas de diagnóstico molecular han revolucionado la detección de patologías y la administración de tratamientos oportunos, su principal ventaja es que se basan en la detección de segmentos de ADN sin necesitar la presencia de un microorganismo viable en la muestra. Además, por su alta sensibilidad y especificidad analítica y diagnóstica, junto con la rapidez con la que se pueden obtener los resultados las ha transformado en las técnicas de elección para el diagnóstico de enfermedades infecciosas y en muchos casos se consideran los estándares de oro (gold standard) para el diagnóstico de otras enfermedades autoinmunes, cáncer estre otras.

En el diagnóstico molecular de cáncer, las técnicas de biología molecular permiten predecir la evolución del cáncer y la elección del tratamiento farmacológico adecuado.

El objetivo del Laboratorio de diagnóstico molecular es brindar un servicio de calidad para el público en general, además de ofrecer apoyo a los grupos de investigación de instituciones públicas y privadas mediante los siguientes servicios: Aislamiento, cuantificación y ensayo de integridad por electroforesis de Ácidos nucleicos (ADN y ARN); determinación de expresión génica por PCR tiempo real; identificación de polimorfismos y niveles de expresión de microRNAs en suero; entre otros servicios.

Servicio	Prueba	Información de la prueba
DIAGNÓSTICO POR RT-PCR	SARS-CoV-2, Influenza A y B	Tipo de muestra: Exudado nasofaríngeo. Condiciones de la muestra: Muestras en refrigeración (4°C) y congeladas entre -40 a -80°C. Cantidad mínima de muestra: Hisopo en 2 mL de medio de transporte. Causa de rechazo de la muestra: Muestra no refrigerada, descongelada, degradada o muestra no tomada correctamente. Método de detección: RT-PCR.
AISLAMIENTO DE ACIDOS NUCLEICOS (ADN Y ARN)	ADNg ARN	Tipo de muestra: Células y sangre congeladas. Condiciones de la muestra: Muestras congeladas entre -40 a -80°C. Cantidad mínima de muestra: células: 1 millón por condición, sangre: 1mL. Condiciones de rechazo: Muestra no refrigerada, descongelada o degradada. Técnica de aislamiento: Kit de aislamiento de ADNg (Promega). Tipo de muestra: Células congeladas. Condiciones de la muestra: Muestras congeladas entre -40 a -80°C. Cantidad mínima de muestra: células: 1 millón por condición. Condiciones de rechazo: Muestra no refrigerada, descongelada o degradada. Técnica de aislamiento: Trizol-Clorofomo.
DETECCIÓN DE MARCADORES EPIGENÉTICOS	Metilación de ADN microRNAs:	Tipo de muestra: ADNg Condiciones de la muestra: Muestras congeladas entre -20 a -80°C. Muestras tratadas con bisulfito. Cantidad mínima de muestra: 3 a 5 µg de ADNg, 200 ng a 5µg de ADN tratado con bisulfto. Causa de rechazo de la muestra: Muestras contaminadas o degradadas. Muestras sin transporte frio (-20 a 4°C). Marcadores determinados: Intrón 1 de Foxp3. Método de detección: PCR punto final-electroforesis, qPCR (SYBR Green). Tipo de muestra: Células congeladas y plasma. Condiciones de la muestra: Muestras congeladas entre -20 a -80°C. Cantidad de muestra: Células 500 a 1 millón por condición. Plasma: 500 µl. Causas de rechazo de la muestra: Muestras contaminadas o degradadas. Muestras sin transporte frio (-20 a 4°C). Muestras hemolizadas o lipémicas. miRNAs determinados: miRNAs: miR-21, miR-29b, miR-34a, miR-146a, miR-155, miR-221, miR326 entre otros. Control: U6 snRNA, miR-39. Método de detección: Expresión relativa por qPCR (Sondas TaqMan).
ENSAYOS BASADOS EN PCR TIEMPO REAL	Polimorfismos (SNPs) Expresión génica (qPCR)	Tipo de muestra: Células, ADNg Condiciones de la muestra: Muestras congeladas entre -20 a -80°C. Cantidad mínima de muestra: 10 a 100 ng/ul. Causas de rechazo de las muestras: Muestras contaminadas o degradadas. Muestras sin transporte frio (-20 a 4°C). Polimorfismos determinados: P2X7, ABCB1, ABCG2, TYMS. Método de detección: Sondas Taqman, PCR convencional. Tipo de muestra: Células, ARN, ADNc. Condiciones de muestra: Muestras congeladas entre -20 a -80°C. Cantidad de muestra: 10 a 500 ng/ul. Causas de rechazo de la muestra: Muestras contaminadas o degradadas. Muestras sin transporte frio (-20 a 4°C). Genes determinados: Genes: PPARy, FOXO3a, NAT1, NAT2, SIRT2, SIRT3, SIRT6, NRF2, A1R, A2AR, A2BR, A3R, FOXP3, ETS1, PTEN, PPAR-a, entre otros. Endógenos: GAPDH, Actina, 18s rRNA. Método de detección: SYBR Green
ASESORÍAS SOBRE METODOLOGÍA Y DISEÑO EXPERIMENTAL	Asesoramiento a los usuarios del servicio de Biología Molecular. Diseño experimental de ensayos de PCR tiempo real y PCR digital en gota (expresión génica, polimorfismos, marcadores epigenéticos) en estudios clínicos y de ciencia básica.
OTROS SERVICIOS	Centrifugación de muestras a temperatura ambiente o en frío. Pruebas rápidas para SARS-CoV-2	Tipo de muestras: Células congeladas, suero, plasma, etc. Condiciones de la muestra: Muestras en refrigeración (4°C). Suero y plasma: sin hemolisis o lipemia. Rango de temperatura: 0 a 25 °C Velocidad: 100 a 140000 rpm Causas de rechazo de la muestra: Muestras contaminadas o degradadas. Muestras sin transporte frio (0 a 25°C). Tipo de muestras: Exudado nasofaríngeo. Condiciones de la muestra: Muestras en refrigeración (4°C), en 2mL de medio de transporte. Causas de rechazo de la muestra: Muestras contaminadas o degradadas. Muestras sin transporte frio (-20 a 4°C). Método de detección: Ensayo inmunocromatográfico para la detección cualitativa de antígenos de Sars-Cov-2.
	Búsqueda de amibas de vida libre en agua de alberca. (Naegleria spp. y Acanthamoeba spp.)	Tipo de muestras: Agua de alberca. Condiciones de la muestra: Muestras de 4 a 25°C, 1L de muestra en recipiente con tapa hermética. Etiquetado con la siguiente información: • Procedencia de la muestra. • Número de retornos. • Fecha de la toma de muestra. • Punto de muestreo. • Hora de muestreo. • Temperatura de muestra. • pH de la muestra. • Volumen de la muestra. Causas de rechazo de la muestra: Muestras sin transporte hermético. Método de detección: Filtración y concentración por sedimentación con Brij-35 al 0.3%.

Servicio de Citometría de Flujo

La Citometría de flujo permite medir simultáneamente múltiples parámetros de cada una de las células o partículas (previamente marcadas con fluorocromos) dentro de una población heterogénea en suspensión a una velocidad de varios miles por segundo, permitiendo identificar diferentes subpoblaciones celulares, comportamientos fisiológicos, etc.

Se proporciona soporte científico y técnico sobre los principios que rigen la técnica y el análisis de los resultados. Se realiza el análisis de diversos analitos para lo que se disponga de reactivos fluorescentes como: Inmunofenotipo con anticuerpos específicos a proteínas de membrana o intracelulares. Expresión de proteínas fluorescentes (Receptores de superficie, factores de transcripción). Detección de Apoptosis (AnexinaV/PI), Proliferación celular (CFSE) y Ciclo celular (tinción de DNA).

	Citometría de Flujo
Servicio	Prueba	Información de la prueba
ANALISIS DE INMUNOFENOTIPO	Básico a) Linfocitos T CD4 (CD3/CD4) b) Linfocitos T CD8 (CD3/CD8) Completo Linfocitos CD4 (CD3/CD4), Linfocitos CD8 (CD3/CD8) Linfocitos B (CD3/CD19) Monocitos (CD14) Celulas NK (CD3/CD16/CD56)	Tipo de muestra: Muestra de Sangre periférica (tubo c/EDTA). Condiciones de la muestra: Transporte a 4°C entre 2 a 24 h, refrigeración hasta 24 h. Cantidad mínima de muestra: 2 ml (Básico) y 4 ml (Completo) de sangre. Método de detección: Panel de anticuerpos acoplados a fluorocromos (FITC, PE, APC, PERcP, etc.). Utilidad del ensayo: Detección y análisis de subpoblaciones de interés al diagnóstico clínico de enfermedades (VIH, LES, AR, Cáncer de mama, etc.).
ANÁLISIS DE MARCADORES EXTRACELULARES E INTRACELULARES	Extracelular a) Marcadores de Activación: CD25, CD38, CD69, CD95. b) Receptores: IL-5Ra, IL-10R, A2aR. c) Marcadores de migración: CD62L, CXCR3. Intracelular a) Citocinas: TNF-a, IL-17, IFN-?, IL-4 b) Factores de transcripción: Foxp3, NF-kB	Tipo de muestra: Muestra de Sangre periférica (tubo c/EDTA). Condiciones de la muestra: Transporte a 4°C entre 2 a 24 h, refrigeración hasta 24 h. Cantidad mínima de muestra: 4 ml de sangre. Método de detección: Panel de anticuerpos acoplados a fluorocromos (FITC, PE, APC, PERcP, etc.). Utilidad del ensayo: Análisis de expresión de moléculas de superficie o intracelulares de interés para estudios clínicos y de ciencia básica y traslacional.
ENSAYOS DE MUERTE CELULAR O APOPTOSIS	Ensayo de Apoptosis y necrosis mediante Anexina V y Ioduro de propidio (IP)	Tipo de muestra: Muestra de Sangre periférica (tubo c/EDTA). Condiciones de la muestra: Transporte a 4°C entre 2 a 24 h, refrigeración hasta 24 h. Cantidad mínima de muestra: 6 a 10 ml de sangre periférica. Compuesto a evaluar: Sujeto a lo solicitado por el cliente Método de detección: Sonda fluorescente para la detección de apoptosis (Anexina V) e intercalador al ADN fluorescente para la detección de necrosis (Ioduro de Propidio) Utilidad del ensayo: Análisis de viabilidad celular y/o evaluación de la citotoxicidad de compuestos o materiales para uso clínico (micropartículas, nanopartículas, fármacos de recién creación).
ENSAYOS DE PROLIFERACIÓN CELULAR	Proliferación celular por detección de Diacetato de carboxifluoresceina (CFSE)	Tipo de muestra: Muestra de Sangre periférica (tubo c/EDTA). Condiciones de la muestra: Transporte a 4°C entre 2 a 24 h, refrigeración hasta 24 h. Cantidad mínima de muestra: 6 a 10 ml de sangre periférica. Compuesto a evaluar: Sujeto a lo solicitado por el cliente Método de detección: Detección de la distribución del compuesto fluorescente Diacetato de carboxifluoresceina (CFSE) en las células iniciales e hijas. Utilidad del ensayo: Evaluación de los posibles efectos en la activación y proliferación celular de los estímulos o tratamientos a analizar. Evaluación de los efectos anti-proliferativos de nuevos tratamientos antineoplásicos.
ENSAYO DE CICLO CELULAR (IP)	Evaluación del ciclo celular mediante la detección de Ioduro de Propidio (IP)	Tipo de muestra: Muestra de Sangre periférica (tubo c/EDTA). Condiciones de la muestra: Transporte a 4°C entre 2 a 24 h, refrigeración hasta 24 h. Cantidad mínima de muestra: 6 a 10 ml de sangre periférica. Compuesto a evaluar: Sujeto a lo solicitado por el cliente Método de detección: evaluación del cambio nen las fases del ciclo celular (G1, S, G2, M) mediante la detección del intercalador al ADN Ioduro de propidio. Utilidad del ensayo: Análisis de fases de ciclo celular; detección de aneuploidías para estudios de células cancerígenas.
ANÁLISIS MULTIPARAMÉTRICO DE DATOS	Diseño de paneles de citometría de flujo (combinación entre múltiples parámetros, fluorocromos y moléculas de interés).	Parámetros evaluados: Morfología: FSC y SSC (altura, ancho, área) Fluorocromos: FITC, PE, PercP-Cy5.5, PE-Cy7, APC, APC-Cy7 entre otros.
ASESORÍAS SOBRE METODOLOGÍA Y DISEÑO EXPERIMENTAL	Consultoría y revisión experimental de ensayo de citometría de flujo para proyectos de Ciencia Básica o Clinica	Consultoría y revisión experimental de ensayo de citometría de flujo para proyectos de Ciencia Básica o Clinica

En esta sección se imparten cursos de actualización y capacitación dirigidos a estudiantes y profesionales de las áreas de Ciencias de la Salud, Ciencias Biológicas y Químicas en:

Ensayo in-vitro; diseño experimental y aplicaciones.
Células mononucleares como modelo de estudio en enfermedades metabólicas.
Técnicas de biología molecular aplicadas al diagnóstico clínico.

Consulta aquí el ejemplo de contenido de curso impartido por el laboratorio